بررسی قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی و خصوصی برای صفت عملکرد در ده ایزوله خالص هموکاریون قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید
عنوان صفحه
دلایل عمده عملکرد پایین قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در ایران ---------------------- 8
تاریخچه پرورش قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید -------------------------------------- 10
آشنایی اجمالی با قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید ------------------------------------ 12
طبقه‌بندی ------------------------------------------------------------------ 12
رده بندی ------------------------------------------------------------------ 12
اندام شناسی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید ---------------------------------------- 13
مشخصات پرگنه در کشت خالص ----------------------------------------------- 15
نامگذاری علمی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید:-------------------------------------- 15
تقسیم بندی واحدهای سلولی میسلیوم از لحاظ تعداد و ترکیب‌بندی هستهای ----------- 16
چرخ زندگی قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید ----------------------------------------- 16
الف ـ هموتالیسم ----------------------------------------------------- 19
ب ـ هتروتالیسم ------------------------------------------------------ 20
روشهای بهبود نژادی در قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید:-------------------------------- 24
|
کشت بافت ----------------------------------------------------------------- 25
الف ـ کشت و گزینش تک اسپوری --------------------------------------- 26
ب ـ کشت و گزینش چند اسپوری --------------------------------------- 27
اختلاط ساده---------------------------------------------------------------- 28
تلاقی هدفمند هموکاریونها---------------------------------------------------- 28
1ـ روش سنتی تأیید هموکاریونها--------------------------------------- 29
2ـ تهیه و تایید هموکاریونهای والدی به روش تهیه پروتوپلاست ---------------- 30
3ـ تایید هموکاریونها با استفاده از نشانگر RFLP------------------------------ 30
4ـ تایید هموکاریونها با استفاده از نشانگر RAPD --------------------------- 31
الف ـ استفاده از نشانگرهای غذایی برای تایید هیبریدها:---------------------- 33
ب ـ استفاده از آیزوزایمها برای تایید هیبریدها: ----------------------------- 34
ج ـ استفاده از نشانگرهای مقاومت برای تأیید هیبریدها----------------------- 34
اصلاح برخی صفات با استفاده از روش تلاقی هیبریدها: ----------------------------- 34
1ـ کشت اسپور------------------------------------------------------- 35
2ـ جداسازی تک اسپورها ---------------------------------------------- 36
3ـ تهیه اسپاون ------------------------------------------------------ 36
ب ـ مراحل پرورش و میوه‌دهی: ----------------------------------------- 37
تولید پریموردیا در سطح محیط کشت: ------------------------------------------- 38
تولید اجسام میوه دهی در اسپاون----------------------------------------------- 38
ج ـ تولید اندام باردهی در کمپوست-------------------------------------- 39
1ـ انتقال ژن --------------------------------------------------------- 39
2ـ اختلاط پروتوپلاستها------------------------------------------------ 40
تهیه نژادها ----------------------------------------------------------------- 42
روش تهیه محیط کشت غذایی PDA--------------------------------------------- 42
روش کشت هموکاریونها ----------------------------------------------------- 43
روش تلاقی هموکاریونها------------------------------------------------------ 44
نمونه‌گیری از منطقه تلاقی ---------------------------------------------------- 45
تهیه اسپاون مادری از هیبریدها------------------------------------------------- 45
تلقیح دانه‌های گندم با کشت هیبرید--------------------------------------------- 46
الف ـ پاستوریزاسیون و آمونیاک‌زدایی ------------------------------------- 49
ب ـ مایه‌زنی کمپوست ------------------------------------------------- 49
ج ـ خاک‌دهی بستر کشت---------------------------------------------- 49
هوادهی و افت سریع دما------------------------------------------------------- 50
محاسبه قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی و خصوصی ----------------------------------- 53
محاسبه واریانس ترکیب پذیریی عمومی و خصوصی--------------------------------- 53
محاسبه واریانس افزایشی و غالبیت---------------------------------------------- 53
نتایج بررسی سرعت رشد (قطر پرگنه هموکاریونها)-------------------------------- 55
تیپ رشدی پرگنه هموکاریون -------------------------------------------------- 55
نتایج سرعت رشد در هتروکاریو‌ن‌ها --------------------------------------------- 59
نتایج مشاهده‌ای تهیه اسپاون -------------------------------------------------- 60
نتایج مشاهدای آزمون میوه‌دهی ------------------------------------------------ 60
جدول تجزیه واریانس برای صفت عملکرد در دورگ‌ها ------------------------------- 61
جدول قابلیت ترکیب‌پذیری عمومی در هموکاریونها -------------------------------- 64
جدول قابلیت ترکیب‌پذیری خصوصی دورگ‌ها ------------------------------------- 64
جدول مقادیر اجزاء ژنتیکی ---------------------------------------------------- 66
ضریب همبستگی ------------------------------------------------------------ 66
منابع ---------------------------------------------------------------------- 69
پیوست--------------------------------------------------------------------- 75
چکیده انگلیسی ------------------------------------------------------------- 78
امروزه تأمین غذا و بویژه پروتئین در کشورهای در حال توسعه به یکی از مسائل بنیادی تبدیل شده است. پروتئین مورد نیاز انسان از دو منبع اساسی شامل منابع حیوانی و دیگری منابع گیاهی قابل تأمین است. پروتئین گیاهی شامل حبوبات، غلات و میوه‌جات و سبزیجات است و پروتئین حیوانی عمدتاً شامل گوشت دامها، طیور، آبزیان و فراورده‌های لبنی و دامی می‌باشد. در ایران، کمبود میزان بارش سالیانه، تخریب اراضی کشاورزی، جنگلها و مراتع، آلودگی بیش از حد منابع آبی، عدم استفاده صحیح و اصولی از نهاده‌های زراعی و مهمتر از همه سوء مدیریت، باعث مشکلات زیادی در تأمین پروتئین شده است. هم اکنون کشور ما بیش از 65 میلیون جمعیت دارد و پیش‌بینی می‌شود تا سال 1400 هجری شمسی این رقم به80 میلیون نفر برسد. با افزایش روزافزون جمعیت و تغییر الگوی مصرف مقدار غذای سرانه و مصرف کل غذا افزایش خواهد یافت. با توجه به مشکلات فوق، در آینده یکی از بحرانی‌ترین مسائل کشور ما، مسئله تأمین پروتئین خواهد بود. در این میان تولید و پرورش قارچ خوراکی از چند نظر حائز اهمیت است، که عبارتند از:
1ـ تأثیر اندک شرایط محیطی و آب و هوایی بر پرورش قارچ خوراکی:
قارچ خوراکی در بیشتر مناطق آب و هوایی کشور بدون تجهیزات و امکانات ویژه قابل پرورش است. زیرا تولید و پرورش آن در مکان‌های کنترل شده و سربسته صورت می‌گیرد. همچنین پرورش قارچ از لحاظ صرفه‌جویی در استفاده از زمین، قابل توجه می‌باشد.
2ـ صرفه اقتصادی:
برای تولید و پرورش قارچ خوراکی از بقایای گیاهی محصولات کشاورزی از قبیل کاه و کلش و سایر مواد زاید گیاهی استفاده می‌شود و نیز کمپوست مصرف شده در پرورش قارچ، می‌تواند به عنوان کود آلی مرغوب در باغها و مراتع مورد استفاده قرار گیرد. از سوی دیگر تهیة منابع پروتئینی دیگر، در مقایسه با قارچ، هزینه بشتری دارد.
3ـ ارزش غذایی:
قارچ خوراکی با میزان پروتئین 30ـ25 درصدی هم‌ردیف حبوبات و بالاتر از سبزیجات و میوه‌ها قرار دارد. همچنین هضم 80ـ70 درصدی پروتئین قارچ حائز اهمیت است و میزان کربوهیدرات‌ها و کلسترول در آن پایین است. به دلیلی پایین بودن کالری در قارچ یک رژیم غذایی مناسب برای لاغری است. قارچهای خوراکی دارای ترکیبات ضدسرطان نیز می‌باشند. با مصرف قارچهای خوراکی می‌توان ویتامین‌های C,E,K,D,A و گروه (B6, B2, B1) B و املاح معدنی مانند پتاسیم، کلسیم، فسفر و مقادیری آهن مورد نیاز بدن را تأمین کرد. برخی از اسیدهای آمینه در قارچ خوراکی شامل لیزین، تریپتوفان، تریپسین و اسید فولیک می‌باشد (محمدی گل تپه، 1379).
همچنین مقایسه برخی از اسیدآمینه‌های موجود در قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید با تخم‌مرغ، که یک منبع غذایی غنی از پروتئین می‌باشد، در جدول 2 آمده است (چنگ و مایلز، 1989)[1].
جدول 1ـ ارزش غذایی قارچ خوراکی تازه به شرح جدول زیر می‌باشد (غلامعلی پیوست، 1375).
| درصـد | مـاده |
| 5/90ـ3/78 | آب |
| 30ـ25 | پروتئین (وزن خشک) |
| 5/3 | پروتئین (وزن تر) |
| 8ـ7/1 | چربی (وزن خشک) |
| 3/0ـ2/0 | چربی (وزن تر) |
| 1ـ8/0 | نمکهای معدنی |
| 12ـ7/7 | خاکستر (وزن خشک) |
| 368ـ328 | انرژی (k cal در 100 گرم) |
جدول 2ـ مقایسه برخی از اسیدهای آمینه موجود در قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید با تخم‌مرغ: (در 100 گرم پروتئین)
| قارچ تکمه‌ای سفید | تخم‌مرغ | اسید آمینه |
| 5/7 | 8/8 | لوسین |
| 5/4 | 6/6 | ایزولوسین |
| 5/2 | 3/7 | والین |
| 2 | 6/1 | تریپتوفان |
| 1/9 | 4/6 | لیزین |
| 2/4 | 8/5 | فنیل آلانین |
| 9/0 | 1/3 | متیونین |
4ـ اشتغال‌زایی:
چنانچه در زمینه ترویج، توسعه و حمایت از پرورش قارچ خوراکی در مناطق مختلف کشور بخصوص روستاها فعالیت شود، می‌توان علاوه بر تأمین مواد غذایی گام مؤثری در جهت ایجاد اشتغال جنبی مناسب و افزایش درآمد کشاورزان برداشت.
در بین قارچهای خوراکی، قارچ تکمه‌ای سفید رایج‌ترین قارچی است که در سراسر جهان کشت می‌شود. پرورش قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در اواسط قرن هفدهم میلادی در فرانسه شروع شده و از دهة 1960 تولید آن به صورت صنعت بزرگی، درآمده است. در مجموع به طور متوسط قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید 38 درصد کل تولید قارچ خوراکی در دنیا را، به خود اختصاص داده است
(دفتر امور گل و گیاهان زینتی و قارچهای خوراکی وزارت جهاد کشاورزی، 1382).
علیرغم اهمیت اقتصادی و تجاری قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید، برنامه اصلاحی برای بهبود عملکرد آن، با مشکلاتی همراه است. یکی از مهم‌ترین مشکلات، به چرخه نامعمول زندگی این قارچ برمی‌گردد که غالباً بجای تشکیل بازیدیوسپورهای تک هستهای، بازیدیوسپورهایی حاوی دو هسته هاپلوئید متفاوت و سازگار از نظر جنسی، تولید می‌کند (استوپ و مایبروک، 1999)[2]. مشکل دیگر، عدم وجود اختلافات مورفولوژیکی قابل مشاهده، بین میسلیوم‌های با منشأ تک اسپوری و چند اسپوری می‌باشد (کریگان، 1992)[3]. همچنین از نظر تندش اسپور، که به عنوان اولین گام در یک برنامه اصلاحی است، بسیار ضعیف و ناهماهنگ است (چنگ و مایلز، 1989)[4]. از دهة 1970 میلادی، الگوی جنسی و چرخه کامل زندگی این قارچ به دقت مورد مطالعه قرار گرفته است. متوسط سرانه مصرف قارچ خوراکی در دنیا، در حدود 5/2 کیلوگرم است در حالی که این میزان در ایران، تنها 160 گرم است و متوسط سرانه مصرف قارچ خوراکی در ایالات متحد امریکا حدود یک کیلوگرم می‌باشد. میزان تولید سالیانه قارچ خوراکی تکمه‌ای سفید در آلمان، در سال 1959، حدود 5100 تن و در سال 1965، حدود 9000 تن و در سال 1967، به مرز 15000 تن رسید در سال 1969 ارزش نقدی تولید جهانی این قارچ از مرز یک میلیارد مارک گذشته بود (غلامعلی پیوست، 1375).
انجام تلاقی بین هموکاریونها و تأیید هیبریدها:
طبق گزارش کسل و همکاران در سال 1988 می‌توان دو نژاد مختلف هموکاریون را به فاصله 2ـ1 سانتیمتر از هم در یک ظرف پتری حاوی محیط کشت غذایی تازه قرار داد. ظرف پتری به مدت دو تا چهار هفته در درجه حرارت درجه سانتیگراد نگهداری می‌شود. در این مدت میسلیوم‌های هموکاریون به طرف یکدیگر رشد میکنند. سپس از منطقه تلاقی دو هیف، ریز نمونه‌هایی برداشت می‌شود و به محیط کشت تازه، منتقل می‌شود. مورفولوژی پرگنه‌های بدست آمده از ناحیه تلاقی و پرگنه والدین هموکاریون مقایسه می‌شود (کسل و همکاران، 1988).[1] طبق گزارش مهتا و همکاران در 1994 موقعی که تلاقی انجام می‌شود، یکی از نشانه‌های انجام هیبرید این است که دورگ‌ها، تولید میسلیوم‌های رشته‌ای و ضخیم میکنند. در اینجا فرض شده است که هر کدام از والدین هموکاریون به تنهایی تولید اندام باردهی نمی‌کنند و در صورت تلاقی موفقیت‌آمیز، دو رگ به دست آمده می‌تواند در آزمون میوه‌دهی تولید اندام باردهی کند (مهتا و همکاران، 1994).[2]
طبق گزارشات کسل و همکاران در سال 1988 از 16 تلاقی موفقیت‌آمیز با روش RFLP که قابل شناسایی بودند سایر تلاقی‌ها که با شکست روبرو شدند، الگوی باندی یکی از والدین را نشان می‌دادند. همچنین طبق آزمایشی که توسط خوش و همکاران در سال 1992 صورت گرفت، هیبریدی حاصل از تلاقی دو هموکاریون مورد سنجش قرار گرفت. نتایج تک اسپور هیبرید حاصله هنگامی که تولید اندام باردهی کرد، مورد ارزیابی RAPD قرار گرفت. نتایج تک اسپور جدا شده در محیط کشت، تندش کرده و رشد آنها از حالت خیلی سریع تا خیلی کند درجه‌بندی شد. سپس از تک‌اسپور‌های جدا شده، استخراج DNA شد و برای واکنشهای RAPD مورد استفاده قرار گرفت. براساس ژنوتیپ‌های دوهموکاریون والدی، مشخص شد که سیزده مکان ژنی هتروآللیک، در هیبرید وجود دارد.
در این آزمایش، پنج تک اسپور رشد کند داشتند که به احتمال قوی باریدیوسپورهایی با یک هسته هاپلوئیدی یا بازیدیوسپورهایی با دو هستة خواهری داشته‌اند. اسپورهایی که تمام باندها را نشان دادند، به احتمال قوی، هتروکاریونهایی با دو هسته غیرخواهری می‌باشند. کالوو ـ بادو نیز در سال 2000 از نشانگر RAPD جهت تأیید تشکیل هترو‌کاریون، بین جدایه‌های تک‌اسپور استفاده نمود. وی مشاهده کرد که DNA هترو‌کاریونی، دارای باند‌های مشترک هر دو هموکاریون بوده ونیز دارای باند‌های اختصاصی هموکاریون ویژه هستند و یا اینکه فاقد باند‌های رایج در هر دو هموکاریون می‌باشند. بنابراین برخی فرآورده‌های RAPD موجود در اجزاء همو‌کاریونی، در طی تشکیل هترو‌کاریون از دست رفته‌اند و فقدان باندها نشان‌دهندة تشکیل هترو‌کاریون است
(کالوو ـ بادو و همکاران، 2000).[3]
الف‌ـ استفاده از نشانگرهای غذایی برای تأیید هیبریدها:
نشانگرهای غذایی براساس نیازمندیهای رشدی، نظیر اسیدهای آمینه ویژه، ویتامین‌ها و غیره تعیین می‌شوند. یک هیبرید می‌تواند از دو نژادی که هر کدام نیازمندی رشدی متفاوتی دارند، تشکیل شود (مهتا و همکاران 1994). [4] آنچنان که در هیبرید حاصله هر کدام از نژادها، نیاز نژاد دیگر را برطرف می‌کند. البته نشانگرهای غذایی به آسانی در دسترس نیستند و به علاوه ممکن است حتی در صورت موجود بودن، به دلیل اثر پوشانندگی سلولهای میسلیومی چندهسته‌ای، قابل تشخیص نباشند بنابراین، برای اهداف ویژه، امکان به دست آوردن نشانگرهای غذایی مطلوب، برای هر نژاد وجود ندارد.
ب‌ـ استفاده از آیزوزایمها برای تأیید هیبریدها:
آیزوزایمها فرمول‌های مولکولی چندگانه یک آنزیم هستند و توسط ژنهای جداگانه، کنترل می‌شوند، آیزوزایمها در ژل الکتروفورز تولید باندهایی میکنند که براساس الگوهای باندی گروههای مختلف آنزیم‌ها برای یک نژاد ویژه، مشخص می‌شوند. از این روش در آمریکا برای تأیید هیبریدها، استفاده زیادی شده است. در آزمایش رویز و همکاران در 1983 میلادی تنها درصد کمی از نمونه‌ها (کمتر از 5درصد) در چندین مکان ژنی، هموزایگوس بودند که نشان می‌داد، آنها هموکاریون هستند (رویز و همکاران، 1983).[5]
[1] - Castle et al., 1988
[2] - Mehta et al., 1994
[3] - Calvo – Bado et al., 2000
[4] - Mehta et al., 1994
[5] - Royes et al., 1983