بررسی اثر عصاره برگ زیتون و ترکیب اصلی آن(اولئوروپئین) بر سمیت سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین در سلول های PC12
بیماری پارکینسون یک اختلال تخریب کننده نورونی شدید و پیش رونده سیستم عصبی مرکزی است که یکی از شایع ترین اختلالات حرکتی میباشد. برای اکثر بیماری‌های تخریب کننده عصبی اقدامات موجود حکم مسکن را دارند. به علت اینکه شواهد متعددی پیشنهاد میکنندکه دربسیاری از بیماری‌های تخریب کننده نورونی مرگ سلولی غیر عادی رخ میدهد، داروهایی که بتوانند مرگ سلولی را متوقف کنند ممکن است از تخریب نورونی بیشتر جلوگیری کرده و پیشرفت بیماری را آهسته کنند. ترکیبات عمده عصاره برگ زیتون فنول هایی مانند اولئوروپئین میباشند، که آثار ضد آپوپتوزی از خود نشان میدهند بنابراین، مطالعه حاضر جهت بررسی اثر عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین بر سمیت سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین بر روی سلولهای PC12 به عنوان مدل in vitro بیماری پارکینسون طراحی شد. جهت القاء سمیت سلولی، سلولهای PC12 با 150 میکرومول 6-هیدروکسی دوپامین تیمار شدند. در گروههای درمانی دوزهای متفاوت برگ زیتون(g/mlμ600-100) واولئوروپئین(g/mlμ25-5) جهت بررسی اثر احتمالی محافظت کننده آنهااستفاده شد. سمیت سلولی توسط تست MTT تعیین شد. میزان ROS داخل سلولی توسط پروب فلورسنس دیکلرو فلورسین دی استات از طریق روش فلوریمتری ارزیابی شد. قطعات DNA وپارامترهای بیوشیمیایی آپوپتوز (Bax, Bcl2 و caspase3) به ترتیب توسط الکتروفورز در ژل آگارز و ایمونوبلاتینگ ارزیابی شدند. نتایج ما نشان دادند که افزایش 6-هیدروکسی دوپامین منجر به افزایش میزان آسیب سلولی، تولید ROS داخل سلولی، فعال شدن کاسپاز3، قطعهقطعه شدن DNA و همچنین افزایش نسبت Bax/Bcl2 میگردد. تیمار با عصاره برگ زیتون(μg/ml 400و600) و اولئوروپئین ( μg/ml20و25) اختلالات ذکر شده را کاهش میدهد. روی هم رفته نتایج پیشنهاد میکنند که عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین در برابر آپوپتوز القاء شده در اثر 6-هیدروکسی دوپامین اثر محافظت کننده نورونی دارند. حداقل بخشی از این اثر محافظت کننده به واسطه کاهش آپوپتوز نورونی اعمال میگردد و پیشنهاد کننده پتانسیل دارویی عصاره برگ زیتون و اولئوروپئین برای کاهش تخریب عصبی سلولهای دوپامینرژیک میباشد.
کلمات کلیدی:عصاره برگ زیتون، 6-هیدروکسی دوپامین، آپوپتوز، سلولهایPC12، اولئوروپئین.
فهرست مطالب:
فصل اول... 1
1-1 معرفی بیماری پارکینسون. 2
1-2 فاکتورهای دخیل در بیماری پارکینسون. 4
1-2-1 افزایش سن.. 4
1-2-2 فاکتور های محیطی.. 4
1-3 سیستم یوبی کوئیتین پروتئوزوم 16
1-3-1 فاکتورهای ژنتیکی دخیل دربیماری پارکینسون. 17
1-4 التهاب عصبی و بیماری پارکینسون. 21
1-4-1 نقش فعال شدن گلیال ها در بیماری پارکینسون. 22
1-4-2 تغییرات ریز محیط ها در بیماری پارکینسون. 23
1-5 معرفی گیاه زیتون. 23
1-5-1 خصوصیات شیمیایی عصاره برگ زیتون. 24
1-6 اولئوروپئین به عنوان ترکیب اصلی برگ زیتون. 28
فصل دوم.. 30
2-1 مواد و روشها 31
2-1-1 وسایل مورد استفاده. 31
2-1-2 مواد و داروهای مورد استفاده. 31
2-1-3 بافرها و محلولهای مورد استفاده. 32
2-2 جمع آوری برگ زیتون. 34
2-3 تهیه عصاره برگ زیتون. 34
2-4 کشت سلول. 35
2-5 سنجش بقای سلولی. 35
2-5-1 MTT assay 35
2-6 سنجش ROS داخل سلولی. 37
2-6-1 گروههای مورد استفاده در تست ROS. 38
2-7 استخراج DNA از سلولهای PC12 39
2-7-1 گروههای مورد آزمایش جهت استخراج DNA 40
2-8 الکتروفورز قطعات DNA.. 41
2-8-1 گروههای مورد آزمایش در وسترن بلات... 41
2-8-2 استخراج پروتئین از سلولهای PC12 42
2-8-3 اندازه گیری کل پروتئین.. 43
2-8-4 بررسی میزان پروتئینهای درگیر در آپوپتوز (Bax, Bcl-2, Caspase 3) با استفاده از روش وسترن بلات 44
2-8-5 الکتروفورز پروتئینها روی ژل SDS-PAGE.. 44
2-8-6 انتقال از ژل به کاغذ PVDF. 45
2-8-7 بلاکینگ 46
2-8-8 مرحله شستشو. 46
2-8-9 اضافه کردن آنتی بادی اولیه. 47
2-8-10 اضافه کردن آنتی بادی ثانویه. 47
2-8-11 افزودن سوبسترا و ثبت باندهای نورانی روی فیلم رادیولوژی.. 47
2-8-12 ظهور فیلم.. 48
2-8-13 زدودن آنتی بادیهای متصل به آنتی ژن از روی کاغذ و کنترل لودینگ نمونه ها 48
2-8-14 آنالیز تصاویر گرفته شده از باندهای پروتئینی.. 49
2-9 آنالیز آماری. 49
فصل سوم.. 50
3-1 نتایج. 51
3-1-1 بررسی تأثیرات غلظتهای متفاوت 6-هیدروکسی دوپامین بر بقای سلولهای PC12. 51
3-1-2 بررسی اثرات دوزهای متفاوت عصاره بر سلولهای PC12 52
3-1-3 بررسی اثرات دوزهای متفاوت اولئوروپئین بر سلولهای PC12 53
3-1-4 بررسی اثرات دوزهای متفاوت عصاره برگ زیتون(OLE) بر بقای سلولهای PC12کشت شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین.. 54
3-1-5 بررسی اثرات دوزهای متفاوت اولئوروپئین بر بقای سلولهای PC12کشت شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین 55
3-1-6 بررسی اثرات دوزهای موثر عصاره برگ زیتون بر میزان تولید ROS داخل سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین 56
3-1-7 بررسی اثرات دوزهای موثر اولئوروپئین بر میزان تولید ROS داخل سلولی ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین 57
3-1-8 آنالیز نتایج به دست آمده از وسترن بلات برای پروتئینهای درگیر در آپوپتوز سلولی.. 58
3-1-9 بررسی اثرات عصاره برگ زیتون واولئوروپئین بر قطعه قطعه شدن DNA ناشی از 6-هیدروکسی دوپامین 63
فصل چهارم.. 64
4-1 بحث و نتیجه گیری. 65
4-2 بروز استرس اکسیدایتو وآپوپتوز در بیماری پارکینسون. 65
4-3 عملکرد کانال های کلسیم و بیماری پارکینسون. 72
4-4 بروز التهاب نورونی در بیماری پارکینسون. 73
4-5 نتیجه گیری کلی. 76
4-6 پیشنهادها 77
فهرست اشکال:
شکل 1- 1:تولید گونه های واکنش پذیر اکسیژن د راثر پارکوات 8
شکل 1- 2: مکانسیم القاء سمیت عصبی توسط 6-هیدروکسی دوپامین.. 13
شکل 3- 1:بررسی اثر غلظتهای متفاوت 6-هیدروکسی دوپامین بر بقای سلولهای PC12 با استفاده از تست MTT 51
شکل 3- 2: بررسی اثر غلظتهای متفاوت عصاره برگ زیتون بر بقای سلولهای PC12 با استفاده از تست MTT 52
شکل 3- 3: بررسی اثر غلظتهای متفاوت اولئوروپئین بر بقای سلولهای PC12 با استفاده از تست MTT 53
شکل 3- 4: بررسی اثر غلظتهای متفاوت عصاره برگ زیتون بر بقای سلولهای PC12 در حضور 6-هیدروکسی دوپامین با استفاده از تست MTT. 54
شکل 3- 5: بررسی اثر غلظتهای متفاوت اولئوروپئین بر بقای سلولهای PC12 در حضور 6-هیدروکسی دوپامین با استفاده از تست MTT. 55
شکل 3- 6: بررسی اثر غلظتهای متفاوت عصاره برگ زیتون بر میزان ROS تولید شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین 56
شکل 3- 7: بررسی اثر غلظتهای متفاوت اولئوروپئین بر میزان ROS تولید شده در حضور 6-هیدروکسی دوپامین 57
شکل 3- 8: بررسی بیان کاسپاز 3 فعال شده در گروههای تیمار شده با 6-هیدروکسی دوپامین و عصاره برگ زیتون 59
شکل 3- 9: بررسی بیان کاسپاز 3 فعال شده در گروههای تیمار شده با 6-هیدروکسی دوپامین و اولئوروپئین 60
شکل3- 10: بررسی بیان نسبت Bax/Bcl-2 در گروههای تیمار شده با 6-هیدروکسی دوپامین و عصاره برگ زیتون 61
شکل3- 11: بررسی نسبت Bax/Bcl-2 در گروههای تیمار شده با 6-هیدروکسی دوپامین و اولئوروپئین 62
شکل3- 12:بررسی قطعه قطعه شدن DNA در حالت تیمار با 6-هیدروکسی دوپامین همراه با دوزهای موثر اولئوروپئین و عصاره برگ زیتون. 63