کشت پروتوپلاست گیاهی، سلول گیاهی، بافت و کشت اندام گیاهی
روشهای سنتی اصلاح نباتات مبتنی بر دستکاری ساختار ژنتیکی گیاه کامل و از طریق تولید جنسی است. در سالهای اخیر روشی برای دستکاری ژنتیکی در سطح سلولی پیدا شده است که روشهای اصلاحی را بطور منحصر بفرد کامل می کند. موجودیت پیدا کردن روشهای کشت بافت و سلول را می توان به پیشرفتهای ناشی از دانش کشت سلولی و زیست شناسی مولکولی دانست (4 و 51)
بیوتکنولوژی یا فناوری زیستی مجموعه ای از فنون را تشکیل می دهد که امکان بکارگیری، توانایی و کارآیی سلولهای موجودات زنده اعم از حیوانی یا گیاهی را فراهم می سازد. در سالهای اخیر با انجام تحقیقات متعدد در حوزة بیوتکنولوژی کشاورزی این بخش دارای جایگاه مهم و باارزشی شده است و این امکان را در رابطه با گیاهان زراعی فراهم نموده است که بسیار مطالب کارآتر از روشهای کلاسیک اصلاح نباتات با استفاده از تکنیکهای مختلف از قبیل دست ورزی ژنتیکی (Genetic manipulation)، کشت بافت و سلول گیاهی در شرایط In Vitro و غیره، گیاهانی با سازگاری متناسب تر و بیشتر به شرایط محیطی و همچنین سازگار با نیاز انسانها تولید نماید.
تکنیک کشت بافت و سلول گیاهی در شرایط In Vitro ازجمله فنون بیوتکنولوژی است که کاربرد آن به اوایل سالهای 1950 می رسد. بر اساس این تکنیک، سلول گیاهی یا بافت از اندامهایی مثل ریشه، ساقه، برگ و گل آذین یا هر اندام دیگری از گیاه جدا شده و در شرایط کاملاً استریل و گندزدایی شده، در درون لوله های آزمایش محتوی محیط غذایی مصنوعی قرار گرفته و با تأمین نیازهای نوری و حرارتی مناسب تبدیل به یک گیاه کامل می گردد. این تکنیک همانطور که اشاره شد امکان تولید هزاران گیاهچه مشابه گیاه مادری را در مدت زمان بسیار کوتاهی و در فضای فیزیکی بسیار محدودی فراهم میسازد که با انتقال این گیاهچه ها به سطح گلخانه و مزرعه تولید انبوهی از گیاهان مورد نظر را می توان باعث شد. در اصلاح نباتات با استفاده از تکنیک کشت بافت و نیز تولید کالوس یا گیاهچه ها در مقیاس وسیع و انجام گزینش در بین نمونه ها می توان از ارقام مقاوم به استرسهای محیطی را تولید نمود. فنون فوق فرصتهای مناسبی در بخشهای مختلف تحقیقاتی، اقتصادی بوجود آورده است که با تقویت بخش دولتی و فعال نمودن بخش خصوصی کارایی این بخشها را برای تأمین و تولید محصولات اساسی کشور را، بطور قابل ملاحظه ای می توان افزایش داد. (51 و 98)
تاریخچة اهمیت کشت بافت:
مفهوم کشت بافت گیاهی خلاصة عبارت کشت پروتوپلاست گیاهی، سلول گیاهی، بافت و کشت اندام گیاهی است. کشت بافت و سلول گیاهی بر اساس نظریة شوان مبنی بر دارا بودن خاصیت توتی پوتنسی سلولها پایه گذاری شد. توتی پوتنسی خاصیتی است که بر اساس آن یک سلول دارای توان تبدیل شدن به موجود کامل است. در سالهای اخیر، تکنیک کشت بافت گیاهی به یک ابزار بسیار قدرتمند برای تکثیر و اصلاح بسیاری از گونه های گیاهی تبدیل گشته است. این تکنیک با ابراز نظریة گوتلیب هابرلاندت در مورد خاصیت توتیپوتنسی در سلول گیاهی در آغاز قرن بیستم آغاز گردید. هارلاند پیشنهاد نمود که روشهای جداسازی و کشت اندام گیاهی باید توسعه یابد و ادعا نمود که اگر محیط و مواد غذایی سلولهای کشت شده، دستورزی شده باشند، آن سلولها باید صفات ارثی مربوط به مراحل رشد و نموی گیاه اولیه را تکرار نمایمد. دیدگاه هابرلاند در حقیقت قابل توجه بود زیرا وی حتی بیان داشت که خارج از سلولهای سوماتیکی زنده، جنینهای مصنوعی به صورت غیر جنسی رشد و نمو می یابند.(5) احتمالاً وایت نخستین کسی بود در سال 1954 مسئله کشت سلولی را به روشنی بیان کرد. او بیان داشت که تفاوتهای بین سلولهای دیگر در آن ارگانیسم می باشد. لذا امکان دارد بتوان با جدا نمودن سلول، پتانسیل نهفته توتی پوتنت را به آنها بازگردانید. البته احتمال دارد که این خاصیت در سلول برای همیشه از دست رفته باشد. اسکوگ و میلر در 1957 پیشنهاد نمودند که اثرات متقابل کمی بین اکسین و سیتوکینین نوع رشد و مراحل مورفولوژیک را که باید در گیاه رخ دهد، تعیین می کنند. مطالعات آنها در توتون نشان داد که نسبت بالای اکسین به سیتوکسین باعث القای رشد ریشه می شود؛ درحالیکه نسبت بالای سیتوکسین به اکسین باعث القای رشد ساقه میگردد، هرچند که این الگو پاسخ کلی و عمومی نیست. (1 و 5 و 9 و 98)
دستورزی نسبت اکسین به سیتوکینین در بسیاری از گونه ها و جنسها برای ریخت زایی موفقیت آمیز بوده است. کارهایی که توسط مورل[1] (1960) روی ازدیاد ارکیده انجام گردیده است، آغازی برای کاربرد تکنیک کشت بافت گیاهی برای تکثیر و اصلاح بسیاری از گونه های گیاهی بود که منجر به توسعه و گسترش استفاده از محیطهای کشت جدید با غلظتهای بالای نمک توسط موراشیگ و اسکوک[2] گردید.
در سال 1966 نیز گوها[3] و محشوری[4] امکان ایجاد تعداد زیادی از گیاهچه هاپلوئید از دانه داتوره بوسیله کشت بساکهای نابالغ را ثابت کردند. (98)
در سال 1970 اولین امتزاج موفقیت امیز پروتوپلاست در محیط کشت تحقق یافت. در همین سال انتخاب موتانهای بیوشیمیایی در شرایط آزمایشگاهی صورت گرفت. در 1974 تولید گیاهان هیبرید حاصل از امتزاج پروتوپلاستهای هاپلوئید به نتیجه رسید. (1 و 98)
تحقیقات در زمینه کشت بافت گیاهی از سال 1975 به بعد بطور چشمگیری افزایش یافت و از دهة 1980 به بعد به عنوان بخش مهمی از بیوتکنولوژی گیاهی مورد توجه بسیاری از دانشمندان قرار گرفته است بطوریکه در سال 1977 توسط چلتون و همکاران ادغام موفقیت آمیز DNA پلاسمید Ti از Agrobacteriam tumefaciens به گیاهان صورت گرفت. (98 و 100)
در حال حاضر کشت بافت به عنوان پیش نیاز مهندسی ژنتیک از اهمیت ویژه ای برخوردار است. از طرفی کشت بافت بعنوان مکمل روشهای کلاسیک متداول در اصلاح نباتات بکار می رود نه جایگزین آن (86 و 100)
اساس گیاه شناسی برای کشت بافت:
ظرفیت طبیعی گیاهان به منظور تکثیر توسط فرآیندهای غیرجنسی، اساس تکثیر در تکنیک کشت بافت است. کشت بافت به سادگی به ما کمک می کند تا از پتانسیل طبیعی موجود در گیاه برای رشد و تکثیر استفاده کنیم که البته تکنیکی بسیار کارآمد و قابل پیش بینی است (62 و 96)
اهداف مورد نیاز با استفاده از تکنولوژیهای جدید کشت بافت و مهندسی ژنتیک:
تکثیر سریع گیاهان جهت استفاده در تحقیقات اصلاحی ژنتیکی.
تولید گیاهان هاپلوئید و دای هاپلوئید
ایجاد هیبریداسیون سوماتیکی بین گونه ای و بین جنسی
ایجاد موتاسیونهای القایی
حفظ و نگهداری منابع گیاهی از طریق کشت بافت
انتقال ژنهای خارجی مطلوب به سلولهای مورد نیاز از طریق کشت بافت و مهندسی ژنتیک
تولید گیاهان عاری از ویروس
ایجاد لاینهای مقاوم به امراض و بیماریها
ایجاد لاینهای مقاوم به شوری و خشکی
تهیه لاینهای مقاوم به علف کشها
منابع:
1- امیدی، م (1379). بررسی کشت بافت، تنوع سیتوژنتیکی و پروتئینی جو. رساله دکتری تخصصی اصلاح نباتات (ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک) دانشکده کشاورزی دانشگاه تهران
2- باقری. ع (1376) مبانی کشت بافتهای گیاهی. دانشگاه فردوسی مشهد 406 صفحه
3- تورز.کا.سی (1373) فنون کشت بافت برای گیاهان باغبانی خوشخوی. م(مترجم) چاپ اول مرکز نشر دانشگاه شیراز صفحه (1-103)
4- عبدمیشانی. س و ع. الف. ش. بوشهری (1377) اصلاح نباتات تکمیلی (جلد اول) بیوتکنولوژی گیاهی.
5- فاضل زاده.ع. (1382) بررسی تأثیر تیمارهای دمایی بر باززایی کالوس در کشت جنین نارس جو. پایان نامه کارشناسی ارشد اصلاح نباتات دانشکده کشاورزی دانشگاه تهران.
6- کوچکی،ع،مترجم. (1373) زراعت در مناطق خشک. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد. 202 صفحه
7- مطلبی آذر. ع و ع. جعفری مفیدآبادی (1379) بررسی میزان کالزایی، جنین زایی سوماتیکی و باززلیی گیاه در جمعیتهای یونجه ایرانی با استفاده از چهار روش رایج، دانش کشاورزی جلد 1 شماره 2 صفحات 1-13.
8- مهرابی.ع.1. (1381) بررسی کال زایی و باززایی در کلزا و امکان ارزیابی مقاومت به شوری در این گیاه با استفاده از تکنیک کشت بافت. پایان نامه کارشناسی ارشد اصلاح نباتات. دانشکده کشاورزی دانشگاه تهران.
9- نوری قنبلانی، ق. مترجم (1371) تجربیاتی در کشت بافتهای گیاهی، انتشارات دانشگاه تبریز. شماره 323. 411 صفحه
10-ولیزاده، م و کامیا. ت. 1372. بررسی کال زایی، رشد کال و پروتئین کال در گونه های یونجه (Medicaago) اولین کنگره علوم زراعی ایران. مشهد.
11-Agrawal. L.R, (1998) Fundamenteds of plant breeding in hybrid seeds.
12-Alexander I.K, Debchev P.D, Attanassov A.I. & Scrag A.H (1994) Alfalfa embryo production in airlift vessels via Domatic embryigenetsis, Plant cell, Tissue and Organ cutture 38:19-23
13-Allen, S.G., A.K. Dobrenz, and P.G. Bartels. 1986. Physiological response of Salt-tolerant and non tolerant alfalfa to salinity during germination. Crop Scince 26:1004-1008
14-Al-Niemi, T.S. W.F. camphell, and M.D. Rumbaugh. 1992. Response of alfalfa cultivars to salinity during germination and post germination growth. Crop Scince 32:976-980
15-Arcyones, Davey.M.R, Santos. A.V. P and Cockyng. E. (1982) Somatic embryogenesis in tissue from mesophyl and
با کمک روشهای سیتوشیمی میتوان ساختمانهای شیمیایی اجزاء سلول را در وضعیت طبیعی ( In Situ ) آن شناخت دو راه را برای این منظور وجود دارد :
1) استفاده از مواد شیمیایی که در اثر تماس با مواد دیگر درون سلول واکنشی ظاهر سازند که به کمک میکروسکوپ الکترونی قابل رؤیت است .
برای مطالعة با میکروسکوپ نوری بایستی این مواد شیمیایی رنگی باشند و برای مشاهده در میکروسکوپ الکترونی باید این مواد مانع حرکت الکترونها، یا باعث پراکندگی آنها گردند. (1)
2 ) امکان دوم استفاده از آنزیمهایی است که بطور اختصاصی موادی را تجزیه نمایند این مواد بعداً در سلول قابل رؤیت نیستند تعیین اینکه محصول یک واکنش جزئی از ساختمان سلول است یا خیر زمانی ممکن است که نتیجه واکنش سبب انباشتگی و تراکم ماده مورد جستجو گردد علاوه بر این واکنش باید طوری اختصاصی باشد که قضاوت قابل اعتمادی را ممکن سازد از طرف دیگر اجزاء سلولی به قدر کفایت طبیعی باقی بمانند تا مقایسه و قضاوت را ممکن سازند (مثلاً تراکم موادی در میتوکندری زمانی قابل اثبات است که ساختمان میتوکندری به شکل طبیعی آن موجود باشد با دو مثال مطالب فوق روشن میگردد :
در نقاط مختلف سلول فسفاتاز یعنی آنزیمی که هیدرولیز فسفات را تسریع مینماید وجود دارد اگر یک سلول ثابت شده با آلدئید را (آلدئید فعالیت آنزیمی را از بین نمیبرد) با مخلوطی از فسفات محلول و نیترات سرب مجاور کنیم (قطرهای روی بافت قرار میگیرد) در نقاطی که آنزیم موجود است فسفات هیدرولیز شده و تولید اسید فسفریک مینماید که خود در اثر ترکیب با نیترات سرب فسفات سرب به وجود میآورد .
این ترکیب غیر قابل حل در آب بوده و تولید رسوبی مینماید که به شدت الکترونها را متفرق میکند به این ترتیب تمام نقاطی که دارای فسفاتاز هستند در سلول مشخص میگردند .
دیواره غالب سلولهای گیاهی دارای سلولز میباشد که با املاح فلزات سنگین کنتر است ندارد اگر آنزیم سلولاز را روی سلول ثابت شده با آلدئید اثر دهیم سلولز به موادی که ملکولهای ریز قابل حل در آب تبدیل میگردند این عمل منجر به از بین رفتن کنتر است تقاطعی که قبلاً سلولز وجود داشت میگردد با این روش میتوان پی به مقدار کمی سلولز در دیواره سلولزی و احتمالاً چگونگی سنتز آن پی برد . (2)
اتورادیوگرافی ( AUTORADIOGRDHY ) :
ایزوتوپهای رادیواکتیو ایزوتوپهایی هستند که هسته آنها در اثر تشعشع پیوسته تحلیل میرود این گونه ایزوتوپها در سیتولوژی برای ردیابی مواد معینی در سلول به کار گرفته میشود با کمک منوساکاریدهای علامتگذاری شده با14 Cمیتوان بوسیله روشهای اتورادیوگرافی یا به طور مستقیم توسط اندازهگیری فعالیت تشعشعی اجزاء مختلف سلول سنتز پلیساکاریدها را مشخص کرد روش اخیر با کمک دستگاه مخصوصی به نام سینسیلاسیون شمار (نور ساطع کردن و برق زدن = Scintilation ) انجام میگیرد .
در روش مستقیم اتورادیوگرافی میتوان از میکروسکوپ نوری یا الکترونی استفاده کرد در هر دو مورد بافت بعد از دریافت ماده رادیو اکتیو ( خوراندن ـ تزریق ) ثابت آغشته و برش داده میشود مقاطع بعداً با لایهای حساس یا فیلم پوشانده میشوند تشعشعات ماده رادیو اکتیو مثل اشعه نور صفحه فیلم یا ماده حساس دیگر را متأثر و فیلم پس از ظهور در محل سیاه شده مورد مطالعه قرار میگیرند شرط موفقیت دراتورادیوگرافی انتخاب ماده حساس برای پوشاندن مقاطع انتخاب زمان دقیق برای تأثیر اشعه و بالاخره ظاهر کردن مناسب ماده حساس یا فیلم میباشد معذالک نمیتوان از این روش در هر موردی از سیتولوژی استفاده نمود اتورادیوگرافی بیش از هر روش دیگر به دقت و تجربه نیازمند است . (2)
جداسازی اجزاء سلول :
برای انجام آزمایشات شیمی با اندازهگیری و مطالعه عمل اجزاء مختلفه یک سلول : لازم است که این اجزاء از بقیه قسمتها جدا گردند برای این منظور سلولها هموژن میشوند بعد محتویات سلولها با کمک اولترا سانتریفوژ به صورت بخشهای مستقلی که هر یک محتوی ساختمان خاصی از سلول هستند از هم جدا میگردند .
عمل هموژن کردن در سلولهائی که با دیواره سختی پوشیده نمیشوند از طریق شوک اسمزی با تأثیر امواج صوتی بالای Hkz 20 صورت میگیرد .
سلولهای بادیواره سخت بایستی در هموژنیزاتور با چاقو یا گلولههای شیشهای ذرات کوارتز و نظایر آن ساییده شوند در هر حال این عمل نباید موجب آسیب و در نتیجه کاهش فعالیت اجزاء سلولهای گردد عمل سانتریفوژ کردن در دو مرحله انجام میگیرد :
1 ) نوع ساده DiFFERENCIAL CENTIFU GATION
2 )جدا کردن به طریق هموژنی ( ISOPICNIC )
کروماتوگرافی ( CHROMATOGRAPHY ) :
با کمک روشهای کروماتوگرافی ملکولهای مختلف بر اساس ویژگیهای متفاوت خود نظیر ملکولها ( فیلترژلهای ) حلالیت در دو فاز ( کروماتوگرافی تقسیمی ) و بالاخره خصوصیات جذبی ( کروماتوگرافی جذبی ) از یکدیگر جدا میگردند . (3)